28 setembro 2013

Biologia molecular nas doenças do neurônio motor.



1-     Edmar Zanoteli, 2- Ana Beatriz Alvarêz Peres, 3- Acary Souza Bulle Oliveira,  4- Alberto Alain Gabbai.

Trabalho realizado na Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina - UNIFESP-EPM.
1 - Professor Adjunto Substituto, Disciplina de Neurologia, UNIFESP
2 - Doutora em Medicina, Centro de Genética Médica, Departamento de Morfologia, UNIFESP
3 - Doutor em Neurologia, Chefe do Setor de Investigação em Doenças Neuromusculares, Disciplina de Neurologia, UNIFESP
4 - Professor Titular, Chefe da Disciplina de Neurologia da UNIFESP


RESUMO:

As motoneuronopatias correspondem a um grupo amplo de doenças caracterizadas pelo comprometimento dos neurônios motores superior, inferior ou ambos. Na criança a forma mais comum de motoneuronopatia é a amiotrofia espinhal progressiva, associada com mutações no gene SMN (sobrevida do neurônio motor) em mais de 90% dos casos. No adulto (doenças do neurônio motor), apenas uma percentagem menor que 15% dos casos correspondem a formas familiares. Neste grupo a forma mais comum está associada com mutações no gene da enzima superóxido dismutase (SOD1). No entanto, novos locus genéticos vêm sendo freqüentemente descritos nas formas de doença do neurônio motor do adulto. O objetivo deste trabalho é o de apresentar uma revisão da literatura dos conhecimentos atuais quanto aos aspectos genéticos das motoneuronopatias.

Doenças do neurônio motor, Esclerose lateral amiotrófica, amiotrofia espinhal progressiva, Aspectos genéticos.

INTRODUÇÃO

Motoneuronopatia é um termo genérico utilizado para incluir um grupo de doenças degenerativas caracterizadas pelo comprometimento primariamente do corpo celular do motoneurônio (neurônios motores corticais, do tronco cerebral e espinhais (segundo neurônio)). Na infância a principal forma de motoneuronopatia é a amiotrofia espinhal progressiva (AEP), uma doença de herança autossômica recessiva com grande variabilidade quanto a época de início e gravidade do comprometimento motor.

A poliomielite se caracteriza por paralisia flácida assimétrica dos membros decorrente de processo
infeccioso viral acometendo as células do corno anterior da medula espinhal. Devido a vacinação em massa da população contra o poliovírus, casos novos da doença não têm sido registrados. No entanto, na vida adulta alguns pacientes com seqüela de poliomielite desenvolvem uma piora lentamente progressiva do quadro motor caracterizando a síndrome pós-pólio.

As quatro principais síndromes clínicas de início na vida adulta incluídas dentro das motoneuronopatias,
também conhecidas como doenças do neurônio motor (DNM), são: atrofia muscular progressiva (AMP), esclerose lateral primária (ELP), paralisia bulbar progressiva (PBP) e esclerose lateral amiotrófica (ELA). A denominação ELP é utilizada naqueles casos em que houver acometimento puro do neurônio motor superior (NMS). O termo AMP é empregado quando houver envolvimento isolado do neurônio motor inferior (NMI). O envolvimento combinado de lesão do NMS e NMI caracteriza o quadro de ELA. O termo PBP é empregado quando ocorre acometimento isolado ou predominante dos neurônios motores bulbares. No entanto, há muita discussão na literatura se estas síndromes devam ser consideradas entidades isoladas ou se estariam inseridas no contexto da ELA, correspondendo apenas fases ou manifestações clínicas distintas da mesma doença.
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A AMP é um tipo de DNM que se caracteriza pelo acometimento puro do NMI, com ou sem manifestação
de fraqueza da musculatura bulbar. Representa cerca de 5 a 20% dos casos de DNM. Manifesta-se  clinicamente com fraqueza muscular, hipotonia, atrofia e fasciculações, geralmente de início assimétrico e nos membros superiores e posteriormente envolvendo os membros inferiores e os músculos bulbares. Em geral, os homens são mais afetados que as mulheres e o início das manifestações ocorre mais precocemente que na ELA.
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O principal diagnóstico diferencial deve ser feito com neuropatia motora pura com bloqueio de condução, já que ambas podem ocasionar um quadro clínico bastante semelhante, principalmente no início da  evolução da doença. Anticorpos contra o gangliosídeo GM1 são encontrados em torno de 22 a 84 % dos pacientes com neuropatia motora multifocal.
Confusões podem ainda se estabelecer entre os nomes AMP e AEP, sendo que, o quadro clínico, a faixa etária de acometimento, o prognóstico e o caráter hereditário da AEP são quase sempre suficientes para diferenciá-las. A ELP caracteriza-se por um curso lentamente progressivo de quadriparesia espástica, reflexos tendíneos profundos exaltados, sinal de Babinski bilateral, disartria espástica e labilidade emocional (quadro pseudobulbar).
 A distribuição da fraqueza tende a ser simétrica, com o estágio final marcado por espasticidade difusa. A ELP apresenta um quadro clínico mais insidioso que o da ELA, de início em geral na quinta década de vida, e também um curso mais longo, maior que 3 anos.

Seguimento de longo prazo de alguns desses casos tem sugerido que sinais de comprometimento do NMI tendem a surgir nos estágios mais avançados da doença.
A ELP, como entidade nosológica distinta, permanece controversa, de um lado podendo fazer parte do contexto da paraparesia espástica hereditária e por outro da ELA. A PBP caracteriza-se por  comprometimento predominante da musculatura de inervação bulbar com ou sem envolvimento do NMS. Disartria e disfagia são os sintomas predominantes, acompanhando-se de fraqueza, atrofia e fasciculações de língua.

Associadamente, sinais de comprometimento do NMS ou labilidade emocional podem ser observados.
A ELA se caracteriza pela presença de sinais e sintomas tanto de comprometimento do NMS (espasticidade e hiperreflexia) quanto do NMI (hipotonia, arreflexia, atrofia muscular e fasciculações). É a forma mais comum de DNM de início na vida adulta e, por isso, freqüentemente, o termo ELA é utilizado indistintamente para as outras formas de DNM de início na vida adulta.

A doença afeta preferencialmente pacientes do sexo masculino e, em geral, após os 40 anos de idade.
Apresenta um curso progressivo, com o óbito ocorrendo, em geral, 2 a 5 anos após o início da doença. A
insuficiência respiratória com ou sem pneumonia é a principal causa de óbito, em geral associada a disfagia com broncoaspiração. Os sinais clínicos mais proeminentes são fraqueza, atrofia e fasciculações nos membros, de início assimétrico. Posteriormente a musculatura bulbar e respiratória são também afetadas.

Os pacientes não apresentam comprometimento sensitivo, autonômico ou visual. Os nervos que controlam os movimentos oculares, e os segmentos sacros inferiores da medula espinhal, que controlam os esfíncteres, não são afetados. As funções corticais superiores, como inteligência e memória, não são
comprometidas. Os pacientes podem apresentar labilidade emocional e depressão. De acordo com os critérios de “El Escorial” revisados em 2000, existem vários tipos clínicos de ELA e síndromes relacionadas à ELA que devem ser reconhecidas: A) ELA esporádica, que ocorre isoladamente; B) ELA familiar, em alguns casos associada com mutações no gene da enzima superóxido dismutase (SOD1) e deficiência de hexosaminidase A/B; C) síndrome ELA “plus”, na qual a ELA está associada com manifestações clínicas de outras doenças neurológicas (forma de Guam, sinais extrapiramidais, degeneração cerebelar, demência, envolvimento do sistema nervoso autônomo e anormalidades sensitivas e dos movimentos oculares); D) ELA com anormalidades laboratoriais de significado incerto, nas quais incluem-se as gamopatias monoclonais, autoanticorpos (GM1), endocrinopatias, linfoma, infecções (HIV-1, HTVL-1, varicela zoster, brucelose, borreliose, sífilis), toxinas exógenas (chumbo, mercúrio, alumínio); e E) síndromes que mimetizam a ELA, tais como a síndrome pós-pólio e as neuropatias motoras multifocais com ou sem bloqueio de condução.

Etiologia da ELA

Vários fatores têm sido implicados na patogênese da doença, tais como a deficiência de fatores tróficos, os defeitos no transporte axonal, disfunção dos receptores androgênicos, infecções virais, autoimunidade, fatores tóxicos exógenos, excitotoxocidade endógena, mutações genéticas e anormalidades das mitocôndrias.
Com exceção dos casos familiares, nenhum destes fatores foi identificado como sendo isoladamente a causa da doença. As neurotrofinas têm influência no desenvolvimento e sobrevida dos neurônios, além de exercerem papel protetor e restaurador das funções neuronais.
Os mais implicados são: fator neurotrófico ciliar (CNTF), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), neurotrofinas 3 (NT-3) e 4 (NT-4), fator neurotrófico derivado da glia (GDNF) e fator de crescimento tipo insulina (IGF-1). Muitas destas neurotrofinas funcionariam como potentes protetores neuronais contra o glutamato. .
As proteínas neurofilamentares (NF) são importantes no transporte axonal e na determinação da forma celular e do calibre dos axônios. O acúmulo de proteínas NF no axônio levaria a alteração na densidade dos elementos do citoesqueleto axonal, provocando edema e morte neuronal. Estas anormalidades poderiam ser a causa ou conseqüência da degeneração neuronal.
Títulos elevados de anticorpos antigangliosídeos (GM1), anti-asialo-gangliosídeos (AGM1) e anti-sulfatídeos têm sido encontrados no soro e no líquido cefalorraqueano de pacientes com ELA, numa freqüência maior do que em indivíduos normais e com outras DNM, sugerindo que em alguns casos de ELA um mecanismo autoimune poderia estar contribuindo para a lesão do motoneurônio.

A incidência elevada do complexo ELA/Parkinson/demência na população da ilha de Guam tem sido associada a ingestão de produtos provenientes de palmeira, que contém uma substância chamada de B-N- metilamino-L-alanina (BMAA) neurotoxina exógena. .
Defeitos na recaptação do glutamato extracelular ou aumento na sua liberação nos terminais nervosos levam a um acúmulo desse neurotransmissor na fenda sináptica, causando aumento na transmissão excitatória nos receptores N-metil-D-aspartato (NMDA), facilitando a entrada excessiva de cálcio nas células e por conseguinte de dano celular.
A perda da função dos transportadores de glutamato sódio-dependente produz níveis elevados
de glutamato extracelular. Diferentes tipos de transportadores de glutamato, especialmente os
aminoácidos excitatórios-transportadores 1 e 2 (AAET 1 e 2), têm sido estudados na ELA.

O cálcio intracelular, em quantidade excessiva, leva a ativação de enzimas lisossomais que causam danos à célula e, uma vez no interior da mitocôndria, desencadeiam o desacoplamento da síntese de ATP da oxidação respiratória. Com a mitocôndria inativa, a produção de ATP é reduzida. A redução de ATP resulta na diminuição da atividade das enzimas Ca2+ - ATPases, as quais provocam o aumento do cálcio intracelular, resultando num ciclo vicioso e gerando morte celular.

 ELA familiar
Em torno de 5 a 10% dos casos de ELA são familiares.A idade de início tende a ser 10 a 15 anos mais cedo do que para a ELA esporádica, podendo ainda apresentar um início juvenil ou adulto jovem. A sobrevida tende a ser menor que nos casos de ELA esporádica.
Aproximadamente 10% dos casos familiares são causados por mutações no gene da enzima da cobre/
zinco superóxido dismutase (SOD1) no cromossomo 21.

Normalmente, a SOD1 realiza a dismutação do radical livre superóxido (O) em água oxigenada (H2O2) e oxigênio molecular (O2). Acredita-se que a diminuição da atividade da SOD leva ao acúmulo do íon superóxido, que liga-se então ao óxido nítrico (NO) para formar os radicais livres peroxidonitrila (ONOO) e hidroxila (OH). O acúmulo de radicais livres é altamente lesivo para a célula, pois provoca peroxidação das membranas e modificação de proteínas (nitritação aberrante dos resíduos de tirosina), culminando com a morte do motoneurônio.
 Já foram descritas mais de 90 mutações dispersas pelos 5 exons do gene SOD1, na grande maioria dos casos com herança autossômica dominante .
 A substituição da valina pela alanina na posição 4 (A4V) é a mutação mais freqüente (50% dos casos) e correlaciona-se com uma sobrevida menor que nas outras formas familiares.
Ao contrário, a presença das mutações G37R, G41D e G93C prediz uma sobrevida mais longa.
A presença dasmutações G37R ou L38V correlaciona-se com um início mais precoce do quadro.  Giess et al (2002)  mostraram que em pacientes com ELA familiar decorrentes de mutações no gene (SOD1)
e também em casos esporádicos de ELA o gene do fator neurotrófico ciliar (CNTF) teria um efeito modificador, levando a um início mais precoce da doença Hentati et al (1998) mapearam um outro “locus” no cromossomo 15 (15q15.1-q21.1) em pacientes com ELA de herança autossômica recessiva e com início mais precoce (ELA tipo 5). Chance et al (1998) analisaram uma grande família com quadro clínico de ELA com início juvenil (segunda década), de evolução lentamente progressiva, e de herança autossômica dominante, e mapearam o gene no cromossomo 9 (9q34) (ELA tipo 4).

Yang et al (2001) e Hadano et al (2001) identificaram mutações no gene de uma proteína denominada “alsin” em raros casos de ELA juvenil de herança autossômica recessiva (ELA tipo 2). Mutações no gene “alsin” também foram descritas em pacientes com ELP de início juvenil.
Eymard-Pierre et al (2002) descreveram mutações no gene “alsin” em várias famílias com uma forma grave de paraparesia espástica de início juvenil. Assim, mutações no gene “alsin” seriam responsáveis em alguns casos familiares pela degeneração dos neurônios motores superiores, de início na infância (paraparesia espástica hereditária) ou juvenil (ELP), com ou sem envolvimento dos neurônios motores inferiores (ELA juvenil).
Mais recentemente, em uma grande família europeia com ELA, de herança autossômica dominante, e de início na vida adulta, Hand et al (2002) identificaram um novo “locus” no cromossomo 18 (18q21) (ELA tipo 3).

Atrofia muscular espinhal (AEP) A AEP é uma doença genética de início na infância que afeta o corpo do neurônio motor no corno anterior da medula espinhal, ocasionando hipotonia e fraqueza musculares difusas simétricas de predomínio nas porções proximais dos membros e arreflexia tendínea profunda.
Conforme a época do início da doença e a gravidade do comprometimento motor, a AEP tem sido
dividida em três formas: O tipo I (doença de Werdnig-Hoffmann, ou forma grave) é caracterizado por um início precoce, antes dos 6 meses de vida, e grave comprometimento motor e respiratório. As crianças não chegam a sentar sem apoio e mais de 90% delas não sobrevivem após os 2 anos de idade. O tipo II (forma intermediária) apresenta um início antes dos 18 meses de vida; as crianças são capazes de sentar sem apoio, porém não chegam a deambular. O tipo III (doença de Kugelberg-Welander, ou forma leve) possui um quadro clínico mais brando, com início após os 2 anos de vida, caracterizado por fraqueza e atrofia musculares das cinturas; os pacientes, em geral, apresentam algum período de deambulação.

Em 1995, dois genes candidatos para a AEP foram identificados no cromossomo 5: SMN (sobrevida do neurônio motor) e NAIP (proteína inibidora da apoptose neuronal). Nesta região existem duas cópias homólogas do gene  SMN  (uma cópia telomérica e outra centromérica).  A cópia telomérica, também chamada de SMN1 difere da cópia centromérica (SMN2) por apenas 5 pares de base, sendo duas nos exons 7 e 8. Acima de 90% dos pacientes com quadro clínico de AEP são causados por deleção  homozigótica do gene SMN1..
Embora as duas cópias do gene sejam transcritas, apenas a cópia telomérica teria importância funcional,
pois é a cópia que se encontra ausente nos casos de AEP.
 Além do mais, em torno de 4 % dos indivíduos normais apresentam deleção homozigótica dos exons 7
e 8 da cópia centromérica do gene SMN. Em um dos maiores centros de reabilitação do Brasil,  analisando pacientes com AEP tipos 2 e 3 encontramos deleção do gene SMN1 em 87% dos casos.
Vários estudos têm mostrado que o número de cópias do gene SMN2 é maior nos pacientes com AEP tipos II e III do que no tipo I, devido a conversão do gene  SMN1 em SMN2.
 O maior número de cópias do gene SMN2 produziria um fenótipo mais brando, já que o  SMN2 seria
capaz de codificar até 20% da proteína funcional. Tal observação é fortalecida pela análise da expressão da proteína SMN na medula espinhal, na qual o nível da proteína funcional produzida nos pacientes com AEP tipos II e III é maior que no tipo I.
A diferença de 1 pb no exon 7 do  SMN2 afeta a eficiência da incorporação do exon 7 no RNAm,  roduzindo uma proteína menor e menos funcional. Assim, estudos recentes têm identificado substâncias capazes de afetar a incorporação do exon 7 no RNAm do gene, o qual favoreceria a produção de uma proteína mais funcional. Andreassi et al. (2001) demostraram que a aclarubicina seria capaz de aumentar a retenção do exon 7 no SMN2 transcripto, aumentando a expressão da proteína SMN em fibroblastos de crianças com AEP; e Chang et AL (2001) mostraram que o butirato de sódio facilitaria a incorporação do exon 7 no SMN2 transcrito, aumentando a expressão da proteína em modelos animais de AEP.
A cópia telomérica do gene NAIP pode ser distinguida do seu pseudogene centromérico pela presença do exon 5 apenas na cópia telomérica.
A ausência do exon 5 do gene NAIP tem sido observada mais freqüentemente nos pacientes com AEP tipo I do que nos tipos II e III, sugerindo a presença de uma maior deleção na AEP tipo I.
Um outro gene também localizado no cromossômo 5 é responsável pela codificação da proteína p44, uma
subunidade do fator de transcrição basal TFIIH.
Deleção deste gene tem sido observada em aproximadamente 70% dos pacientes com AEP tipo I, mas a presença da deleção nos parentes e em indivíduos normais sugere que este gene não teria importância na patogênese da AEP.
DNM de início na vida adulta e os genes SMN e NAIP Moulard et al (1998) encontraram em um grupo de
14 pacientes com diagnóstico de AMP dois casos com deleção no gene SMN1 (configurando o diagnóstico de AEP de início tardio) e 36% com deleção do gene SMN2, uma porcentagem muito acima daquela observada na população normal (até 5%). Nos casos de ELA (177 pacientes) e ELP (66 pacientes) os autores encontraram deleção do gene SMN2 em apenas 6,2% e 1,5% respectivamente; uma percentagem próxima ao esperado, comparando-se com a população normal. Os casos de ELA e ELP com deleção do gene SMN2 não apresentaram diferenças estatísticas comparando-se
com os casos sem deleção considerando a época o início, a sobrevida média, e o sexo. Em contrapartida, os casos de AMP com deleção do gene SMN2 apresentaram um início mais precoce da doença e um quadro clínico mais grave com relação aos casos de AMP sem a deleção, sugerindo que de alguma forma a ausência do gene SMN2 poderia interferir na patogênese da doença, ou mesmo funcionaria como um fator de predisposição genética.
Deleção homozigótica do gene  NAIP foi encontrada em apenas um caso de ELA no estudo de Jackson et al (1996) e no estudo de Moulard et AL (1998); percentagem semelhante aquela encontrada na população geral.

Conclusão

Enquanto que mais de 90 % das crianças com doença do neurônio motor possuem defeito genético já identificado (SMN), menos de 20 % dos pacientes com doença do neurônio motor de início na vida adulta, possuem defeito genético identificado ou são familiares, sugerindo neste grupo um efeito acentuado de fatores exógenos.
Muitas teorias têm sido propostas para explicar a etiopatogênese da ELA. Provavelmente mais de um fator esteja contribuindo para a morte precoce do motoneurônio. Como estes mecanismos interagem ainda não está esclarecido.
A detecção de novos genes envolvidos trará informações sobre outros possíveis mecanismos
envolvidos, e assim ampliar o conhecimento dos eventos responsáveis pela morte neuronal.  O uso de drogas capazes de interferir nestes mecanismos poderão prolongar a sobrevida neuronal, enquanto o desenvolvimento e a aplicação prática da terapia gênica não esteja efetivada. Uma das propostas de terapia gênica seria o uso de vetor viral para transportar o gene da EAA2 (transportador de aminoácidos excitatórios) para a medula espinhal, através de injeção intraparenquimal, com o objetivo de reduzir os níveis de glutamato.  Uma outra abordagem seria a utilização de células tronco (“stem-cell”), para promover uma redução na velocidade de degeneração neuronal.



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